واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR

تکنیک زنجیره ای پلیمراز یا روش PCR نام خود را از یکی از ترکیبات کلیدی خود، DNA  پلیمراز می گیرد، که جهت تهیه تعداد بسیار زیادی کپی از یک رشته DNA مورد نظر بکار گرفته می شود. با ادامه روند PCR از تعداد کپی های اولیه یک قطعه DNA، که ممکن است یک یا تعداد بسیار کمی باشند، به عنوان الگو استفاده شده و به میزان بسیار زیادی در حد چندین میلیون کپی تولید می گردد. که محصول نهایی PCR را به طور کلی آمپلیکون (Amplicon) گویند.

تقریبا تمام DNA پلیمراز مقاوم به حرارت را جهت انجام پلیمریزاسیون به کار می گیرند که یکی از مهمترین آنها آنزیم Taq DNA Polymerase است که  از باکتری Thermus aquaticus موجود در چشمه های آبگرم جوشان بدست می آید. این آنزیم نوکلئوتیدهای مختلف را مطابق با تریب الگوی DNA اولیه در کنار هم قرار می دهد تا رشته جدید بوجود آید.

این تکنیک در سال ۱۹۸۴ توسط کاری مولیس (Kary Mullis) معرفی شده و بطور سریعی در اکثر آزمایشگاههای جهان جهت اهداف مختلف بکار گرفته می شود. که برخی از آنها عبارتند از: کلونینگ DNA برای تعیین توالی (Sequencing)، فیلوژنی بر پایه DNA، بررسیهای عملکردی ژنها، تشخیص های ارثی ، شناسایی و انگشت نگاری ژنتیکی و ردیابی و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال ۱۹۹۳ مولیس بخاطر ابداع این روش، جایزه نوبل را دریافت نمود.

مولیس مخترع تکنیک PCR

اساس و روش کار PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز  یا PCR جهت تقویت ناحیه و یا قطعه خاصی از DNA (DNAهدف) بکار گرفته می شود، که می تواند یک ژن واحد، قسمتی از ژن یا توالی غیر کد کننده باشد. اکثر روشهای PCR بطور تیپیک قطعاتی با اندازه حدود ۱۰Kbp را تقویت می کنند ولی در برخی روشها تا Kbp40 نیز قابل انجام است، با توجه به اینکه افزایش طول DNA خطر شکستن آن را در حین حملو نقل یا انجام آزمایش افزایش می دهد، افزایش طول قطعه DNA نیاز به رعایت و انجام اعمال اضافی دارد.

بطور کلی مراحل PCR با توجه به شکل به صورت زیر است:

۱-  مرحله آغاز (Initialization step): این مرحله شامل گرم کردن مواد به درمای حدود ۹۶-۹۴ (یا ۹۸ درجه زمانی که از پلیمراز فوق العاده مقاوم به حرارت استفاده می شود) است که معمولا ۹-۱ دقیقه بطول می انجامد. البته اینه مرحله در مواردی بکار می رود که پلیمراز مورد استفاده جهت انجام فعالیت نیازبه گرم شدن دارد که به Hot- start PCR معروف است.

۲-  مرحله دناتوراسیون( Denaturation Step): این مرحله اولین مرحله معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محیط به میزان ۹۸-۹۴ درجه به مدت ۳۰-۲۰ ثانیه است. این عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همدیگر) هم DNA الگو و هم DNA پرایمر از طریق از بین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دورشته DNA و تولید DNA تک رشته ای است.

۳-  مرحله اتصال (Annealing step): در این مرحله درمای واکنش به ۶۵-۵۰ درجه به مدت ۴۰-۲۰ ثانیه کاهش می یابد تا امکان اتصال DNA پلیمراز و پرایمر به DNA الگو که حالا تک رشته ای است فراهم آورد. بطور تیپیک درجه حرارت اتصل حدود ۵-۳ درجه کمتر درجه حرارت ذوب شدن پرایمر انتخاب می شود. مناسب ترین اتصال DNA-DNA بین رشته الگو و پرایمر زمانی ایجاد می گردد که هر دورشته در فاصله نزدیکی از هم قرار گیرند و هرچه توالی پرایمر با توالی رشته الگوی متناسب تر باشد این اتصال قوی تر بوده و اتصال قوی جهت انجام عمل پلیمراز مورد نیاز است.

۴-  مرحله گسترش یا طویل شدن (Extension/Elongation step): درجه حرارت این مرحله به آنزیم پلیمراز مورد استفاده و درجه حرارت اپتیمم مورد نیاز برای آن بستگی دارد. بطور مثال آنزیم Taq پلیمراز در درجه حرارت ۸۰-۷۵ درجه سانتیگراد فعالیت قابل قبول داشته  ولی بطور معمول از درجه حرارت ۷۲ درجه سانتیگراد برای این آنزیم استفاده می شود. در این مرحله پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از ۵’-۳’ در کنار هم قرار داده و در نهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه را تولید می کند.  مدت زمان این مرحله به پلیمراز و طول رشته DNA الگو بستگی دارد. به عنوان یک قانون در درجه حرارت اپتیمم پلیمراز بایستی ۱۰۰۰ نوکلئوتید در دقیقه را پلیمریزه نماید. در شرایط مساعد برای مثال اگر محدودیت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دوبرابر می شود.

۵-  طویل شدن نهایی( Final Elongation): این مرحله فقط یکبار و پس از آخرین سیکل PCR و در دمای ۷۴-۷۰ درجه بمدت ۱۵-۵ دقیقه صورت میگیرد جهت اطمینان از تبدیل کلیه DNAهای تک رشته ای به دورشته ای انجام می گیرد.

۶-  مرحله نهایی (Final Hold): این مرحله در ۱۵-۴ درجه سانتیگراد جهت نگه داری کوتاه مدت محصولات واکنش تا زمان استخراج انجام می گیرد.

کاربرد های مهم PCR

• جداسازی DNA ژنومی
• تقویت و بررسیهای کمّی DNA
• در تشخیص بیماریها که شامل بررسی بیماریهای بدخیم و سرطانها و بیماریهای عفونی است.

مواد و وسایل لازم برای روش PCR

۱- DNA الگو (Template DNA)

روش PCR تكنيكي است كه به واسطه آن مي توان از يك رشته DNA الگو، تعداد زيادي رشته DNA به دست آورد به شرطي كه دو انتهاي رشته   DNAكه قصد تكثيرش را داريم كاملا شناخته شده باشد. قطعه DNA می تواند محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول  PCR دیگری باشد. چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی( قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر شده) و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase  و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد. در مواد غذایی روند زیر برای تهیه DNA  وجود دارد.

۲- دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات (dNTPs)

چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA، بلوک های ساختمانی هستند که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNA جدید بکار میروند و باید كنار هم چيده شوند تا رشته مكمل را ايجاد كنند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر ۲۰۰ نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده، واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، ۱۰ میلی مولار و ۲۵ میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش ۵۰ میکرو لیتری PCR باید ۵ میکرولیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

۳- پرایمرهای Forward و Reverse 

پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در یکی از رشته های DNAی مورد نظر هستند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف، همانند سازی و تکثیر می گردد. از آنجائيکه DNA دو رشته ای است، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است. پرايمرها دو عمل انجام مي دهند؛ اول اين كه محل ژني را كه بايد تكثير شود مشخص مي‌كنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. طول پرايمرها نیز بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي كند. بهتر است دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديك به هم باشند. غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از ۱۰۰ نانو مولار تا یک میکرو مولار متغیر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و نقش بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد.

طراحی پرایمر :

پرایمرهای PCR بصورت کاملا” اختصاصی و مکمل ناحیه مورد نظر DNA هدف طراحی میگردند.

پرایمرها ۳۰-۲۰ باز دارند .اگر پرایمرها خیلی کوتاه باشند ممکن است با بخشهای غیر هدف هیبرید شوند و سبب تکثیر محصولات ناخواسته شوند. پرایمرهای بلند با اینکه موجب تولید محصول اختصاصی میشوند ولی باعث کاهش سرعت هیبرید شدن آن با DNA می شود. به همین دلیل در عمل از پرایمرهایی با طول بیش از  ۳۰ نوکلئوتید بندرت استفاده می شود. برای تکثیر توالیهای بزرگ از کلون کردن استفاده میشود. پرایمر باید دمای آنیلینگ بالا داشته باشد. دمای مناسب برای تشکیل هیبریدهای صحیح الگو وپرایمر ۱ تا ۲ درجه پایین تر از دمای ذوب شدن (T_m) است. فرمول محاسبه دمای ذوبT_m=4(G+C)+2(A+T) است. (A+T) مجموع نوکلئوتیدهای آدنین و تیمین موجود در پرایمر و  (C+G)مجموع نوکلئوتیدهای گوانین وسیتوزین موجود در پرایمر است. بهتر است تعداد بازهای دوپرایمر مساوی باشند و از پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند، همچنین نواحی تکرار شونده نداشته باشند. چنانچه بازهای G یا C بصورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر بصورت لوپ در می آید و عملا” سیستم کار نمیکند. انتهای ۳` دو پرایمر نباید مکمل باشد زیرا پرایمر دایمر تشکیل می شود. فاصله دو پرایمر باید کمتر از ۱۰ kb باشد (کارآیی همانند سازی برای محصول PCR بیش از ۳kb کمتر است). برای پرایمرهایی که برای ایجاد موتاسیون در یک ژن و ایجاد تغییر در محصول PCR طراحی میگردند میتوان درسمت پایه ۵` پرایمر یک پروموتور و یا Ribosom Binding Site جایگاه اتصال ریبوزوم تعبیه نمود، همچنین می توان یک Non tanslated leader بین پروموتور و ژن قرار داد تا ناحیه برای شروع سنتز پروتئین مناسب باشد. این کاربرد بنام Expression PCR  گفته می شود. نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast  آنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژن های دیگری می توانندAnneal  گردند.