واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) نام خود را از یکی از اجزای کلیدی واکنش، بنام DNA پلیمراز می‌گیرد، که جهت دست‌یابی به تعداد بسیار زیادی کپی از یک قطعه DNA مورد نظر بکار گرفته می‌شود. در انتهای واکنش PCR تعداد کپی‌های فراوانی، در حد چندین میلیون کپی، از یک قطعه‌ی ژنومی اولیه که DNA الگو می‌باشد، تولید می‌گردد. محصول نهایی PCR را آمپلیکون (Amplicon) می‌گویند.

در واکنش PCR، از DNA Polymeraseهای مقاوم به حرارت جهت پلیمریزاسیون استفاده می‌شود، یکی از مهمترین آن‌ها، آنزیم Taq DNA Polymerase است که  از باکتری Thermus aquaticus موجود در چشمه‌های آبگرم بدست می‌آید. این آنزیم نوکلئوتیدهای مختلف را مطابق با الگوی DNA در کنار هم قرار می‌دهد تا رشته‌ی جدید بوجود آید. این تکنیک در سال ۱۹۸۴ توسط آقای کری مولیس (Kary Mullis) معرفی شد.

مولیس مخترع تکنیک PCR

اساس و روش کار PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت تقویت و تکثیر قطعه‌ی خاصی از DNAی هدف بکار گرفته می‌شود، که می‌تواند یک ژن واحد، قسمتی از ژن یا توالی غیر کد کننده باشد. اکثر روش‌های PCR بطور تیپیک قطعاتی با اندازه حدود Kbp ۱۰ را تکثیر می‌کنند ولی در برخی روش‌های پیشرفته‌تر PCR قطعه‌ی مورد نظر تا Kbp40 نیز تکثیر می‌گردد.

بطور کلی مراحل PCR با توجه به شکل به صورت زیر است:

۱-  مرحله آغاز (Initialization step): این مرحله شامل گرم کردن مواد در دمای حدود ۹۶-۹۴ سانتی‌گراد است که معمولا ۹-۱ دقیقه بطول می‌انجامد. البته اینه مرحله در مواردی بکار می‌رود که پلیمراز مورد استفاده جهت انجام فعالیت نیاز به گرم شدن، مانند Hot- start PCR، دارد.

۲-  مرحله دناتوراسیون( Denaturation Step): این مرحله اولین مرحله‌ی معمول PCR بوده و شامل گرم کردن محیط واکنش به میزان ۹۸-۹۴ درجه به مدت ۳۰-۲۰ ثانیه است. این عمل باعث جدا شدن دو رشته‌ی DNA (هم در خصوص DNA الگو و هم در خصوص پرایمرها)، از طریق از بین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دورشته DNA، از هم و تولید DNA تک رشته‌ای می‌شود.

۳-  مرحله اتصال (Annealing step): در این مرحله دمای واکنش به ۶۵-۵۰ درجه به مدت ۴۰-۲۰ ثانیه کاهش می‌یابد تا امکان اتصال پرایمر به DNA الگو و برهمکنش DNA پلیمراز با این مجموعه فراهم شود. بطور تیپیک درجه حرارت اتصال حدود ۵-۳ درجه کمتر از درجه حرارت ذوب شدن پرایمرها انتخاب می‌شود. مناسب‌ترین اتصال DNA-DNA بین رشته‌ی الگو و پرایمر زمانی ایجاد می‌گردد که هر دو رشته در فاصله‌ی نزدیکی از هم قرار گیرند و هرچه مکمل بودن توالی پرایمر با توالی رشته الگوی بیشتر باشد این اتصال موثرتر خواهد بود.

۴-  مرحله گسترش یا طویل شدن (Extension/Elongation step): درجه حرارت این مرحله به آنزیم پلیمراز مورد استفاده و درجه حرارت اپتیمم مورد نیاز برای فعالیتۀ آن بستگی دارد. بطور مثال آنزیم Taq پلیمراز در درجه حرارت ۸۰-۷۵ درجه سانتیگراد فعالیت قابل قبولی دارد ولی بطور معمول از ۷۲ درجه‌ی سانتیگراد برای استفاده از این آنزیم در واکنش PCR استفاده می‌شود. در این مرحله پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از ۵’-۳’ در کنار هم قرار داده و در نهایت رشته‌ی مکمل رشته‌ی الگوی اولیه را تولید می‌کند. مدت زمان این مرحله به فعالیت پلیمراز و طول رشته‌ی DNA الگو بستگی دارد. به عنوان یک قانون در درجه حرارت اپتیمم، پلیمراز بایستی ۱۰۰۰ نوکلئوتید در دقیقه را پلیمریزه نماید. در شرایط مساعد برای مثال اگر محدودیت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دو برابر می‌شود.

۵-  طویل شدن نهایی( Final Elongation): این مرحله فقط یکبار و پس از آخرین سیکل PCR و در دمای ۷۴-۷۰ درجه بمدت ۱۵-۵ دقیقه صورت می‌گیرد جهت اطمینان از تبدیل تمامیۀ DNAهای تک رشته‌ای به دورشته‌ای انجام می‌شود.

۶-  مرحله نهایی (Final Hold): این مرحله در ۱۵-۴ درجه سانتیگراد جهت نگه‌داری کوتاه مدت محصولات واکنش تا زمان استخراج انجام می‌گیرد.

کاربرد های مهم PCR

• جداسازی DNA ژنومی
• بررسی‌های کمّی DNA
• تشخیص بیماری‌ها شامل سرطان‌ها و بیماری‌های عفونی
• کلونینگ DNA برای تعیین توالی (Sequencing)
• فیلوژنی بر پایه DNA